微生物限度方法学验证

微生物限度检查方法的验证微生物限度检查方法的验证• 细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证—— 准确性（回收率）• 控制菌检查法的验证 —— 专属性细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证验证的目的：确认所采用的方法适合该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定。照此检查法和检验条件进行供试品细菌、霉菌、酵母菌数检查能保证检验结果的准确、可靠。细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证验证的步骤：• 根据样品特性，制定检验方法和检验条件。• 保证验证试验所用的仪器、培养基和试剂等均符合试验要求。• 按制定的方法进行试验。• 根据验证结果，判断是否符合验证的标准。若符合 ,按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，应重新设立验证方案，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证验证时 ， 按供试液的制备和细菌 、 霉菌及酵母菌计数所规定的方法及要求进行 。 对各试验菌的回收率应逐一进行验证 。 验证试验至少应进行 3次独立的平行试验 ， 并分别计算各试验菌每次试验的回收率 。细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证细菌计数验证用菌株： 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。霉菌、酵母菌计数 验证用菌株 ： 白色念珠菌、黑曲霉。菌株选择的原则 :代表性 ,普遍性 ,低或非致病性 ,标准菌株 (或该药品中常见的污染菌 )。菌种的要求： 不得超过 5代。采用适宜的方法保存。加菌量 :50～ 100菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证验证方法选择： 平皿法 （ 包括稀释法 ） 、 薄膜过滤法 、中和法 、 离心沉淀法 、 联合方法 。样品稀释级的选择： 最低稀释级 ， 1养基： 营养琼脂 、 玫瑰红钠琼脂 、 改良马丁培养基 、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基。细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证菌液制备(1)接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至 1035～ 37℃ 培养 18～ 24小时，取此培养液 1菌氯化钠溶液 9采用 10倍递增稀释法，稀释至 1010菌数约为 50～ 100菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证菌液制备(2)接种白色念珠菌的新鲜培养物至 1023～ 28℃ 培养 18～ 24小时，取此培养液 1菌氯化钠溶液 9采用 10倍递增稀释法，稀释至 100菌数约为 50～ 100菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证菌液制备(3)接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上 ， 23～ 28℃ 培养 5～ 7天 ， 加 3～ 无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子 ， 吸出菌液 ， 取 1菌氯化钠溶液 9采用 10倍递增稀释法 ， 稀释至 100使菌数约为 50～ 100菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证供试品的处理：固体： 10g 供试品 +稀释剂至 100体： 10稀释剂至 100菌性供试品可采用加中和剂、自然沉降、离心或薄膜过滤。细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证• 菌液组• 供试品对照组• 试验组• 稀释剂对照组每一验证菌株均应进行上述试验（顺序）。细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证菌液组： 测定所加的试验菌数。平皿法： 取试验用的 1 50～ 100，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2个平皿，按平皿法测定其菌落数。细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证供试品对照组： 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。 （和试验组采用同法）细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证试验组：平皿法： 取试验可能用的最低稀释级供试液 10～100别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2个平皿，按平皿法测定其菌落数。细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证试验组：培养基稀释法（平皿法）： 取试验可能用的最低稀释级供试液 1个平皿再注入 50～ 100别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2份，按平皿法测定其菌落数。细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证试验组：薄膜过滤法： 取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，应在最后一次的冲洗液中加入 50～ 100滤，按薄膜过滤法测定其菌数 。 至少要一张膜。细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证试验组：离心沉淀法： 取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，如供试液含许多药渣，先以低速 500r/～ 5上清液，再以 3000 r/0～ 30取下面 1A)， 并用适当的稀释剂洗涤管底，将洗涤液与液体（ A)一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证稀释剂对照组： 若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释剂替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每 1试液含 50～ 100按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证计数方法的验证 —— 结果判断指标试验组的菌回收率（ ≥70% ）稀释剂对照组的菌回收率（ ≥70% ）细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证试验组的菌回收率计算：（试验组菌落计数 菌液组× %稀释剂对照组的菌回收率计算：稀释剂对照组菌落计数÷菌液组× %每一验证菌株均应进行上述试验。验证试验至少应进行 3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证验证细菌各平皿倾入营养琼脂培养基。验证霉菌、酵母菌各平皿倾入玫瑰红钠琼脂培养基。置规定温度培养 48或 72h,菌落计数。计算回收率。细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证回收率测定举例供试液不用特殊制备方法常规法菌液组： 1平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平均菌数： C)供试品对照组： 最低稀释级供试液 1皿，平行 2个平皿（计算供试液平均菌数： B）试验组： 最低稀释级供试液 11平皿，平行 2个平皿（计算供试液平均菌数： A）回收率 =(A－ B)÷ C× %细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证回收率测定举例供试液不用特殊制备方法培养基稀释法（ 5个平皿）菌液组： 1平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平均菌数： C)供试品对照组： 最低稀释级供试液 1个平皿， 平皿，平行 2份，共 10个平皿（计算 B）试验组： 最低稀释级供试液 平皿，注 5个平皿，平行 2份（计算平均菌数： A)回收率 =(A－ B)÷ C× %细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证培养基稀释法可以是 1个、 5个或更多个平皿。但是更多的平皿由于操作繁琐易污染一般不做。细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证回收率测定举例供试液需用特殊制备方法（如加中和剂或乳化剂等 )常规法菌液组： 1平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平均菌数： C)供试品对照组： 最低稀释级供试液 1平皿，平行 2个平皿（计算供试液平均菌数： B）细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证试验组： 最低稀释级供试液 11平皿，平行 2个平皿（计算供试液平均菌数： A）稀释剂对照组： 稀释剂 +加中和剂或乳化剂 + 1行 2个平皿（计算供试液平均菌数： D）试验组回收率 =(A－ B)÷ C× %稀释剂对照组回收率 =D÷ C× %细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证回收率测定举例供试液需用特殊制备方法（如加中和剂或乳化剂等 )培养基稀释法（ 5个平皿）菌液组 ： 1平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平均菌数： C)供试品对照组 ： 最低稀释级供试液 1个平皿，平皿，平行 2份，共 10个平皿（计算 B）细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证试验组 ： 最低稀释级供试液 +加中和剂或乳化剂1平皿，平行 2个平皿（计算平均菌数： A)试验组回收率 =(A－ B)÷ C× %稀释剂对照组 ： 稀释剂 +加中和剂或乳化剂 + 1行 2个平皿 （稀释剂对照组与试验组同法操作） （计算平均菌数： D)稀释剂对照组回收率 =D÷ C× %细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证回收率测定举例供试液需用特殊制备方法（离心沉淀法）菌液组： 1平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平均菌数： C)供试品对照组： 最低稀释级供试液 10离心， 500稀释剂至 10 取 1平皿，平行 2个平皿（计算平均菌数： B)或 3000稀释剂至 10 取 1平皿，平行 2个平皿（计算平均菌数： B)细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证试验组： 最低稀释级供试液 10心， 500稀释剂至 10取 1平皿，平行 2个平皿（计算平均菌数： A)或 3000稀释剂至 10取 1平皿，平行 2个平皿（计算平均菌数： A)试验组回收率 =(A－ B)÷ C× %稀释剂对照组 ： 取与菌液组细菌浓度相同的稀释剂 10000稀释剂至 10取 1行 2个平皿（计算平均菌数： D)（稀释剂对照组与试验组同法操作）稀释剂对照组回收率 =D÷ C× %细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证回收率测定举例试液需用特殊制备方法（薄膜过滤法）菌液组： 1平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平均菌数： C)供试品对照组： 含 1滤冲洗，至少 1张膜（菌落计数： B)试验组： 含 1滤冲洗， +1滤，至少 1张膜（菌落计数： A)稀释剂对照组： 稀释剂 +菌液，过滤冲洗，至少 1张膜（菌落计数： D)细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证过滤细菌的膜贴在预先倒好并预培养过的营养琼脂培养基平板上，菌面朝上。过滤霉菌酵母菌的膜贴在预先倒好并预培养过的玫瑰红钠琼脂培养基平平板上，菌面朝上。试验组回收率 =(A－ B)÷ C× %稀释基对照组回收率 =D÷ C× %细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证计数方法的确定细菌计数方法与霉菌和酵母菌计数方法可以不一致。细菌以各试验菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）的回收率均能达到 70%以上的检测方法为准。霉菌和酵母菌以各试验菌（白色念珠菌、黑曲霉）的回收率均能达到 70%以上的检测方法为准。细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证计数方法的验证 —— 结果判断在 3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应均不低于 70%。若试验组的菌回收率均不低于 70%，则按此供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数能保证检验结果的准确、可靠。若任一次试验中试验组的菌回收率低于 70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。控制菌检查法的验证试验菌株： 按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。阴性对照菌株 :选择原则，口服选用金黄色葡萄球菌，外用选用大肠埃希菌 。菌种的要求： 不得超过 5代。采用适宜的方法保存。加菌量 :10～ 100证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。试验组： 取规定量供试液及 10～ 100相应控制菌检查法进行检查 设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性，方法同试验组。控制菌检查法的验证控制菌检查验证用菌株： 大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌 。控制菌检查法的验证• 口服制剂验证用菌株： 大肠埃希菌 大肠菌群 沙门菌阴性对照菌菌株： 金黄色葡萄球菌检查方法： 大肠埃希菌按大肠埃希菌项下检查大肠菌群按大肠菌群项下检查沙门菌按沙门菌项下检查控制菌检查法的验证• 外用制剂验证用菌株： 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 生孢梭菌阴性对照菌菌株： 大肠埃希菌检查方法： 铜绿假单胞菌 按 铜绿假单胞菌 项下检查金黄色葡萄球菌 按 金黄色葡萄球菌 项下检查生孢梭菌 按 生孢梭菌 项下检查控制菌检查法的验证验证方法选择： 常规法 、 稀释法 、 薄膜过滤法 、 中和法 、离心沉淀法 、 联合方法 。供试品量： 1沙门菌检查为 10g。培养基： 营 养肉汤培养基 、 胆盐乳糖增菌液 、 胆盐乳糖发酵管 、 四硫磺酸盐增菌液 、 胆盐硫乳 琼脂平板 、 麦康凯琼脂平板 、 溴代十六烷三甲胺平板 、 甘露醇氯化钠平板 、 肉培养基 、 含 庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板 。控制菌检查法的验证菌液制备接种大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌的新鲜培养物至 1035～ 37℃ 培养 18～ 24小时，取此培养液 1菌氯化钠溶液 9采用 10倍递增稀释法，稀释至1010菌数约为 10～ 100制菌检查法的验证• 常规法：大肠埃希菌： 取相当于 100性菌对照加入大肠埃希菌 10～ 100性菌对照加入金黄色葡萄球菌 10～ 10035～ 37℃ 培养 18～ 24小时，取此培养物 察荧光及靛基质试验。阳性菌 基质阳性，则表明该样品对大肠埃希菌没有抑菌作用。阴性菌未检出表明该控制菌检查方法的专属性好。若阳性菌未检出则表明该样品对大肠埃希菌有抑菌作用，需对供试液进行处理。控制菌检查法的验证• 常规法大肠菌群： 取含适量（不少于 10的胆盐乳糖发酵培养基管 3支，分别加入含供试品 阳性菌对照加入 大肠埃希菌 10～ 100阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～ 10035～ 37℃ 培养 18～ 24小时观察结果。若阳性菌检出而阴性菌未检出则表明该样品对大肠菌 群 无 抑菌作用且专属 性好。若阳性菌未检出则表明该样品对 大肠菌群有抑菌作用，需对供试液进行处理。控制菌检查法的验证• 常规法沙门菌： 取供试品 100接或处理后接种至适量（不少于 200营养肉汤培养基中，混匀，阳性菌对照加入 沙门菌 10~100阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～ 100 35～ 37℃ 培养 18～ 24小时，取此培养物 10培养 18～ 24小时后划线于胆盐硫乳 琼脂平板、麦康凯琼脂平板观察结果。若阳性菌检出而阴性菌未检出则表明该样品对 沙门菌 无 抑菌作用且专属 性好。若阳性菌未检出则表明该样品对 沙门菌有抑菌作用，需对供试液进行处理。控制菌检查法的验证• 常规法铜绿假单胞菌： 取相当于 100阳性菌对照加入铜绿假单胞菌 10～ 100性菌对照加入 大肠埃希菌 10～ 10035～ 37℃ 培养 18～ 24小时，取此培养物划线接种于 溴代十六烷三甲铵平板观察结果。若阳性菌检出而阴性菌未检出则表明该样品对铜绿假单胞菌无 抑菌作用且专属 性好。若阳性菌未检出则表明该样品对铜绿假单胞菌 有抑菌作用，需对供试液进行处理。控制菌检查法的验证• 常规法金黄色葡萄球菌： 取相当于 1阳性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～ 100阴性菌对照加入 大肠埃希菌 10～ 10035～ 37℃ 培养 18～ 24小时，取此培养物划线接种于 甘露醇氯化钠平板 观察结果。若阳性菌检出而阴性菌未检出则表明该样品对金黄色葡萄球菌无 抑菌作用且专属 性好。若阳性菌未检出则表明该样品对金黄色葡萄球菌 有抑菌作用，需对供试液进行处理。控制菌检查法的验证• 常规法生孢梭菌： 取相当于 100肉培养基 ,阳性菌对照加入生孢梭菌 10～ 100肠埃希菌 10～ 10035～ 37℃ 厌氧培养 72～ 96小时，取 5~37℃ 厌氧 48~72阳性菌检出而阴性菌未检出则表明该样品对生孢梭菌无 抑菌作用且专属 性好。若阳性菌未检出则表明该样品对生孢梭菌 有抑菌作用，需对供试液进行处理。控制菌检查法的验证结果判断：阴性菌对照组未检出阴性对照菌 ， 试验组检出试验菌 ， 表明该法专属性强 ， 可按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查 。若试验组未检出试验菌 ， 表明该供试品有抑菌作用 ，应采用稀释法 、 离心沉淀集菌法 、 薄膜过滤法 、 中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性 ， 并重新验证 。控制菌检查法的验证• 培养基稀释法：供试品有抑菌作用，放大培养基量，由 1： 100放大为 1： 300、 1： 500或 1： 1000。由于盛放培养基容器体积有限，一般放大到 500000本法适用于抑菌作用不强的中西药制剂，操作简便易行，应用范围广泛。控制菌检查法的验证• 薄膜过滤法：采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。控制菌检查法的验证• 离心沉淀法：取规定量供试液，如供试液含许多药渣，先以低速500r/～ 5取上清液，再以 3000 r/0～ 30取下面 1将适量的稀释剂洗涤管底的洗涤液一并移入同瓶增菌液中，培养。本法适用于中度抑菌作用的中西药制剂。控制菌检查法的验证• 中和法：在供试品溶液中加入相应的中和剂，以减除供试品中抑菌性成分的作用。中和剂应对微生物无毒性，与抑菌成分结合后的产物应对微生物亦无毒性，或有毒性但不影响待检菌的检出。微生物限度检查方法的验证• 中和剂• 常见的有• (1)磺胺类药物 :加入适当的对氨基苯甲酸• (2)含重金属的药物 :在培养基中加入巯基化合物如硫乙醇酸钠 (3)洗必泰制剂 :加入聚山梨酸 80(3%)或卵磷脂 (3%)• (4)卤素 :加入硫代硫酸钠 (微生物限度检查方法的验证（举例）